La amantadina 109

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La amantadina inhibe los receptores NMDA mediante la aceleración de cierre del canal durante Bloqueo de canal Resumen El canal de receptores de NMDA es bloqueado por una amplia variedad de fármacos. Bloqueadores de los canales NMDA receptor incluyen las drogas de abuso que inducen el comportamiento psicótico, tales como la fenciclidina, y las drogas con una amplia utilidad terapéutica, como la amantadina y memantina. Se describe aquí el mecanismo molecular de la inhibición de la amantadina. En contraste con la mayoría de otras moléculas bloqueantes de los canales descritos, amantadina hace que la puerta de canal de los receptores NMDA para cerrar más rápidamente. Nuestros resultados confirman que la amantadina inhibe el flujo de corriente a través de canales de unión del receptor de NMDA, pero muestran que su principal acción inhibidora a concentraciones farmacéuticamente relevantes los resultados de la estabilización de estados cerrado del canal. La sorprendente variación en la utilidad clínica de bloqueadores de los canales NMDA pueden, en parte, se derivan de sus diversos efectos sobre gating canal. Introducción La amantadina es un fármaco de amplia utilidad clínica. Se reconoció por primera vez como un agente antiviral (Davies et al. 1964), pero poco después también fue encontrado para ser útil en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (Schwab et al. 1969). Sigue siendo un fármaco ampliamente utilizado y bien tolerada en el tratamiento de trastornos del movimiento parkinsonianos y también puede ralentizar la progresión de la enfermedad de Parkinson (Blanchet et al. 2003), mejorar el dolor crónico (Fisher et al. 2000), y mejorar la recuperación de lesión cerebral traumática (Meythaler et al., 2002). La utilidad clínica de la amantadina parece resultar de sus acciones como un bloqueador de los canales iónicos. Su acción antiviral resulta de bloque de la pequeña proteína de membrana viral M2 (Hay, 1992). Aunque la utilidad de la amantadina en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson se supuso inicialmente que el resultado de efectos sobre los sistemas dopaminérgicos (Danysz et al. 1997), amantadina más tarde se encontró que bloquear el canal de los receptores NMDA (Kornhuber et al. 1991 Lupp et al. 1992 Parsons et al. 1995 Blanpied et al. 1997). La evidencia creciente sugiere que la eficacia de la amantadina en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso resultados predominantemente a partir de su inhibición de las respuestas NMDA (Blanchet et al. 2003). Bloqueadores de los canales NMDA receptor tienen diversas propiedades. bloque de canales por extracelular Mg 2 es de profunda importancia fisiológica, ya que es responsable de la poderosa dependencia de voltaje de Ca 2 postsináptica afluencia en las sinapsis excitatorias (Dingledine et al., 1999). En contraste con los bloqueadores clínicamente útiles NMDA de canal del receptor, como la amantadina y la memantina derivado, muchos bloqueadores orgánicos, tales como la ketamina y la fenciclidina, inducir un comportamiento esquizofrénico similar en los seres humanos (Jentsch y Roth, 1999) y son neurotóxicos (Olney et al., 1999 ). ¿Por qué las sustancias con una acción farmacológica aparentemente similar, bloqueo de canales de los receptores NMDA, presentan tales propiedades clínicas divergentes datos anteriores sugieren que las posibles variaciones en cualquiera de las acciones de la droga no específicos o en NR2 especificidad subunidad no proporcionan explicaciones adecuadas (Javitt y Zukin de 1991 Bresink et al., 1996 Danysz et al. 1997 Monaghan y Larsen, 1997 Blanchet et al. 2003). En su lugar, la amplia variación en la utilidad clínica puede surgir de las diferencias en los mecanismos de interacción con bloqueador de los receptores NMDA. Aspectos de mecanismo que puede influir poderosamente en las propiedades inhibidoras de un bloqueante de los canales incluyen la cinética y la afinidad de unión y bloqueador de los efectos de la envolvente en el bloqueador de canal de transiciones entre los estados cerrado (Rogawski, 1993 Parsons et al 1999b. Johnson y Qian, 2002). A pesar de la importancia de estos aspectos de la acción bloqueante, actualmente tenemos una comprensión limitada de la interacción entre los receptores NMDA y la amantadina. En este trabajo, se combinaron células enteras y de un solo canal a grabar con modelos cuantitativos para investigar los mecanismos por los que la amantadina inhibe las respuestas NMDA. Se encontró que la amantadina muestra la cinética intermedios de bloque (Hille, 2001), lo que nos permitió medir el bloqueo y desbloqueo de las tasas y la tasa de estimación de cierre del canal con amantadina unido. Se demuestra que, cuando la amantadina está ligada en el canal de los receptores NMDA, que aumenta la velocidad de cierre del canal. Como resultado, el mecanismo inhibidor predominante de la amantadina no es bloqueo del flujo de corriente a través de canales abiertos, sino más bien el aumento de ocupación de canal estados cerrado. Las propiedades inusuales de amantadina pueden desempeñar un papel importante en su seguridad clínica. Materiales y Métodos cultivos celulares y soluciones. Las cortezas cerebrales se aislaron de ratas embrionarias día 16 y se utilizan para preparar las neuronas cultivadas en cubreobjetos de vidrio como se describe previamente (Antonov y Johnson, 1996). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Pittsburgh. Las neuronas fueron utilizados para experimentos después de 2-5 semanas en medio que contenía suero. Para las grabaciones, cubreobjetos se transfirieron a una cámara de registro y se bañaron en una solución extracelular que contenía los siguientes (en m m): 140 NaCl, 2,8 KCl, 1 CaCl 2. y 10 HEPES. pH se ajustó a 7,3 con NaOH. La solución de la pipeta contenía lo siguiente (en m m): 120 CSF, 10 de CsCl, 10 HEPES, y 10 BAPTA. pH se ajustó a 7,2 con CsOH. Se mantuvieron las células 293T de riñón embrionario humano (HEK) como se ha descrito anteriormente (Qian et al. 2005). Para los experimentos, las células se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio tratados previamente con poli-D-lisina y colágeno de cola de rata. Dieciocho a 24 h después de la siembra, las células fueron transfectadas transitoriamente con ADNc que codifican las subunidades del receptor de NMDA NR2B NR1-1a y utilizando un procedimiento de precipitación con fosfato de calcio (Qian et al. 2005). ADNc de la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) se cotransfectó como un marcador de las células transfectadas con éxito. La cantidad de ADNc usado por plato fue la siguiente (en g): 0,7 eGFP, 1,3 NR1-1a, y 2 NR2B. Después de un 6-8 h de incubación en la solución de transfección, las células se lavaron con medio de cultivo fresco que contenía 200 m APV. Los experimentos se realizaron 20 a 72 h después de la transfección. grabaciones de parche exterior hacia fuera. Pipetas fueron extraídos de la pared de vidrio estándar de borosilicato con filamento (Warner Instruments, Hamden, CT), recubierta con Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) y pulidas al fuego. la resistencia de la pipeta varió de 6 a 12 M. Las grabaciones se realizaron con un amplificador Axopatch 200A (Axon instrumentos, Union City, CA). El parche se coloca en frente de la abertura de uno de un par de tubos de perfusión, y la solución se cambió moviendo los tubos. los receptores de NMDA se activan mediante solución que contiene 5 m NMDA y 10 m de glicina sola o con la concentración indicada de la amantadina. Uno a 4 min de aberturas de canal en cada concentración de fármaco se pasa bajos filtrada a 10 kHz y graba en cinta de vídeo para su posterior análisis. El potencial de mantenimiento, después de la corrección para el potencial de unión medido, fue -67 mV. El análisis de un solo canal. Los datos de cinta de vídeo se filtraron usando un ocho polos del filtro de Bessel con un corte de f c 4 kHz y digitalizados a 20 o 41 kHz. Los segmentos que contienen ruido inaceptables fueron eliminadas mediante el Programa de Análisis de canales (R. C. Electrónica, Santa Bárbara, CA). Aperturas y cierres se detectaron con un criterio de umbral 50 (Colquhoun y Sigworth, 1995) utilizando el software de ordenador pClamp 6 (Axon Instruments). El punto de corte eficaz de los filtros en cascada dio lugar a un sistema de estimación de tiempo muerto de 0.179 / 0.048 ms f c, y eventos más breve que el doble del tiempo muerto del sistema (t min) se elimina de todos los histogramas y excluyó del análisis. Los histogramas se presentan como la raíz cuadrada frente a gráficos de tiempo de registro (Sigworth y Seno, 1987). distribuciones del tiempo de permanencia agrupadas (ocho contenedores por década) se ajustaron utilizando el método de máxima verosimilitud. distribuciones de tiempo abierto se adaptan bien por un componente de un solo exponencial (Ascher y Nowak, 1988 Jahr y Stevens, 1990 Antonov y Johnson, 1996). componentes de tiempo abierto adicionales (Howe et al., 1988 Gibb y Colquhoun, 1992 Donnelly y Pallotta 1995 Kleckner y Pallotta, 1995 Antonov et al., 1998 Antonov y Johnson, 1999) no fueron analizados debido a que o bien no eran visibles o muy pequeña. El tiempo de apertura media (o) se corrigió para cierres breves perdidas, que de otro modo podrían causar sobreestimación de o. usando la siguiente ecuación (Ogden y Colquhoun, 1985 Marshall et al 1990 Antonov y Johnson, 1996.): o (T Rec - t meas - t extraño) / (n meas n pierda 1), donde t rec es tiempo de grabación total de el segmento de datos bajo análisis, n es el número meas medida de cierres con duraciones t min. t meas es su duración cerrado resumió, n perderse es el número estimado de cierres con duraciones t min. y t echo de menos es su duración estimada cerrado sumada. n Miss y Srta t se estimaron por extrapolación de la forma cerrada distribuciones de duración del tt min a 0. En condiciones de control, el valor de o calculada por este método fue 4.19 0.26 ms, 98 3 de la aritmética sin ajustar la hora media abierta calcula a partir abierta histogramas - time, lo que confirma la exactitud del cálculo cuando ot min. La corrección tuvo un mayor efecto cuando el tiempo de apertura promedio no ajustado fue más breve. En 100 m amantadina, que aumentó la frecuencia de apertura más breve de lo t min. O era 70 2 de la aritmética sin ajustar el tiempo medio abierta. histogramas de tiempo cerrada en ausencia y en presencia de la amantadina se ajuste bien en la gran mayoría de los casos por la suma de tres componentes exponenciales. En ausencia de la amantadina, estos componentes tenían constantes de tiempo de la siguiente manera: corta duración (C, S), 0,29 0,04 ms de duración intermedia (C, I), 7,22 1,70 ms larga duración (C, L), 494 80 ms con amplitudes relativas de 0,43 0,02, 0,16 0,01, 0,41 y 0,02, respectivamente. Como se describe en los resultados, la duración de los eventos de bloqueo amantadina (C, B) fue similar a C, S significa. La precisión de las estimaciones de C, B se optimiza mediante el establecimiento de criterios conservadores para la aceptación de los datos que se utilizarán en las estimaciones. Los criterios se utilizan para minimizar dos errores potenciales. El primer error potencial resultado de la similitud de C, S y C, B. Estos dos componentes de tiempo cerrado eran demasiado similares como para ser en forma para las exponenciales independientes pero en general no debería tener duraciones idénticas. Por lo tanto, el cierre de los canales de corta duración podrían haber interferido con la medición de C, B. Para minimizar la interferencia de estos breves cierres, aceptamos mediciones C, B sólo si el área del componente de corta duración fue de 0,5 ms (Antonov y Johnson, 1996), limitando aberturas perdidas para un máximo de 18 de todas las aberturas. Debido a que el número de aperturas perdidas aumenta con la concentración de la amantadina, la observación de que la proporción C, B no aumenta con la concentración de la amantadina (ver Fig. 2 B) es compatible con la precisión de nuestra estimación. Sólo los datos en 10 m (6 de 8 parches) y 30 m amantadina (7 de 11 parches) cumplieron con los criterios descritos anteriormente. Los datos que cumplen estos dos criterios se superponen en todos los datos de un solo canal de la Figura 2, B y C. La estimación de la k. k -. e IC 50 de amantadina a partir de experimentos de parche exterior hacia fuera. Las grabaciones se realizaron en 5 m NMDA además de 10 m de glicina con la concentración indicada de la amantadina. A . La dependencia de la concentración de la amantadina o recíproco. La media de valores basado en un total de 48 mediciones a partir de 12 parches se representan en la mayoría de los casos, las barras de error son más pequeños que los puntos. La pendiente de un ajuste de regresión lineal a través de todos los puntos de datos (línea), 40,8 m -1 s -1. se utilizó para estimar k. B. La dependencia de la concentración del componente amantadina duración más corta de la distribución en tiempo cerrado. cuadrados blancos muestran la media de todos los puntos de datos en cada uno de los círculos de concentración llena mostrar la media de tan sólo aquellos que cumplieron los dos criterios que se describen en Materiales y Métodos. La línea se dibuja en la media de todos los puntos de datos. C. La dependencia de la concentración de la amantadina de la zona del componente de corta duración como una proporción de la superficie total de los tres componentes histograma en tiempo cerrado. Los símbolos son como en B. La línea discontinua indica que histogramas en los que el área proporcional de C, B fue de 0,7 fueron excluidos del cálculo de k - (ver Materiales y Métodos). D. IC50 para la inhibición de las respuestas amantadina NMDA en parches. Normalizado n P abierta es igual a P n abierta en la concentración amantadina trazado dividido por n OPEN P medido en el mismo parche en 0 amantadina. Line es mejor ajuste de la ecuación 1 para los datos. Se combinaron los datos de todas las mediciones de parche, como en A. El valor de 1 / C, B proporciona una estimación de la suma de las tasas de abandonar el estado bloqueado (Colquhoun y Hawkes, 1995), que de acuerdo con el modelo 1, es k -. Nuestro uso de 1 / C, B como una estimación del k - solo se basa en la suposición de que k -. Análisis de las duraciones de ráfaga indicó que es de 251 s -1 (ver Resultados). Debido a que esta es mucho menor que el valor estimado de 1 / C, B (4480 s -1), la aproximación k - 1 / C, B debe tener un error de 6. n P abierta (número de canales en un parche multiplicado por probabilidad de apertura por canal medio) se calculó como el tiempo total de canal abierto dividido por el tiempo de grabación utilizando ordenador pClamp 9 (Axon Instruments). Las duraciones de grabación de parches utilizados aquí variaron de 71 a 335 s (media de 163 s). Se realizó un análisis de la explosión para estimar la velocidad de cierre del canal en la ausencia y presencia de la amantadina. duraciones de ráfaga se midieron como la duración de las aperturas con los cierres más breve que la duración del crítico (t crit) cuentan como parte del tiempo de apertura (Colquhoun y Sigworth, 1995). Solamente los parches en la que 1 ms y se incluyen dentro de las explosiones. Los efectos de un bloqueador de atrapamiento en las transiciones de estado de los receptores ayudan a determinar la IC50. A . Esquemática de modelo 1. R es el receptor de NMDA, A es una molécula de NMDA, B es una molécula de amantadina, A 2 D es el receptor desensibilizado, y A 2 R es un receptor en la conformación abierta. Símbolos utilizados para cada constante de velocidad (k) se muestran en el modelo. Las constantes de equilibrio se definen como sigue: para la unión de NMDA, K ak a - / ka y K ak a - / ka para gating canal, K g / y K g / para la desensibilización, K ds k DS - / k ds ds y K k ds / ds k para la unión de la amantadina, K DK - / k. B. Modelo 1 se utilizó para investigar cómo el IC 50 de un bloqueador de los canales de captura es influenciada por los efectos de la bloqueador en el canal gating con A 5 m. curvas predicho concentración-respuesta (ver Materiales y Métodos) se representan por un bloqueador con Kd de 110 m que no tiene ningún efecto sobre el canal gating cuando se unen (K g K G 39 línea continua), que estabiliza el estado abierto del canal (K g 0,1 K g línea discontinua), y que estabiliza el canal del estado (K g 10 K g línea de puntos) cerró. En todas las parcelas, K a K a 11 m y K K ds ds 0.2. C. Modelo 1 se utilizó para determinar que un bloqueador con K d 110 m puede lograr una CI 50 de 38,9 m por la disminución de afinidad agonista (K a 2,35 K a 25,9 m) por sí sola, mediante la estabilización de la canal cerrado estado (K g 2,83 K g 110 ) solo, o estabilizando el estado desensibilizado (K ds ds 0.152 K 0,0304) solos. El análisis de la explosión en presencia de la amantadina fue diseñado para contar eventos bloqueo amantadina como dentro de ráfaga. Debido a que el valor de C, B estaba muy cerca del valor de C, S. los procedimientos utilizados fueron idénticos a los utilizados en la ausencia de la amantadina. Los valores medios de t crítico en la amantadina (1,02 0,11 ms en 10 m. 1,19 0,13 ms en 30 m. Y 1,45 0,06 ms en 100 m amantadina) fueron similares al valor de control (1.23 0.33 ms). células enteras de grabación. grabaciones de células enteras a partir de neuronas cultivadas o células HEK 293T transfectadas se realizaron como se ha descrito previamente (Blanpied et al. 1997), utilizando las mismas soluciones que para las grabaciones de parche fuera-out. aplicaciones rápidas de la concentración de NMDA se indica más 10 m glicina con o sin la amantadina se consigue moviendo un conjunto de tuberías de flujo de alimentación por gravedad bajo control del ordenador. el intercambio de soluciones eran al menos 98 completa dentro de los 120 ms (Blanpied et al., 1997). Todos los experimentos fueron realizados a temperatura ambiente. Ajuste de curvas y el modelado. Las curvas de concentración-inhibición se construyeron ajustando los datos con la siguiente ecuación: (1) donde la respuesta es o bien n normalizada P abierta (véase la figura 2 D.) o I Aman / I Control, Aman es la amantadina (ver Fig 4 B). concentración, IC 50 es el Aman a la que la respuesta es 50 inhibido, y n H es el coeficiente de Hill, que refleja la cooperatividad de la acción del fármaco. La inhibición de las respuestas de células enteras por la amantadina en concentraciones elevadas de NMDA. A . De células enteras registros actuales de inhibición de las respuestas activadas por NMDA 30 m, más 10 m glicina con las concentraciones indicadas de la amantadina. Todos los rastros son de la misma célula. Líneas anteriores huellas indican el momento de la aplicación de NMDA y la amantadina. B. Ejemplo de una curva de concentración-inhibición amantadina de una sola célula (misma célula que se utiliza para huellas en A). Me Aman / controlo es la corriente en estado estacionario en los agonistas más amantadina dividido por la corriente de los agonistas solos y se midió como se muestra en A y C. Actual en agonistas solos se calculó como la media de las corrientes de estado estacionario en agonistas medidos antes y después de la aplicación de la amantadina. La línea es el mejor ajuste de la ecuación 1 para los datos. curvas de concentración-respuesta similares con amantadina en seis a siete concentraciones de 1 a 1000 m se utilizaron para estimar la amantadina IC 50 en 30 m NMDA. C. Los ejemplos de la inhibición por 50 m de la amantadina respuestas activadas por NMDA 30 m más 10 m de glicina y 1000 m de NMDA, más 10 m glicina. Las predicciones de equilibrio de modelo 1 (ver Fig. 3 A) muestra en las figuras 3, B y C. 5. y 6 D se hicieron con las ecuaciones derivadas en el material complementario (disponible en www. jneurosci. org). Las constantes de equilibrio entre los estados de los canales no bloqueados (K a 11,0 m K g 39.0 K DS 0,2) se fijan en valores elegidos como se ha descrito previamente (Dilmore y Johnson, 1998), basado en mediciones anteriores (Benveniste y Mayer, 1991 Lester et al. 1993 Rosenmund et al. 1995). Debido a que las estimaciones de máxima P abiertos (que se establezca K g) por los receptores NMDA han variado en gran medida, un valor de K G no se pudo establecer con confianza. Sin embargo, las predicciones basadas en el modelo 1 muestran en las Figuras 3 C. 5. y 6 D varía sólo ligeramente cuando K g se varió de 39 correspondiente a una máxima P abierto de 0.025 (Rosenmund et al. 1995) a 2,33 que corresponde a una P máxima abierto de 0,3 (Jahr, 1992). Del mismo modo, nuestras conclusiones generales no se ven afectados por los cambios en los valores de K una o ds K dentro de un intervalo plausible fisiológica. La Kd de la amantadina se fijó en 110 m. que es igual a la relación de constantes de velocidad (k - / k) determinados aquí a partir de mediciones de un solo canal. Las constantes de equilibrio entre los estados de los canales bloqueados se establecieron para igualar las constantes de equilibrio correspondientes para los canales no bloqueados, excepto cuando se indique lo contrario. Burst-duración de ajuste y las predicciones (ver Fig. 6 C) se realizaron con la Ecuación 2, que se deriva en el material complementario (disponible en www. jneurosci. org). Predicho y medido dependencia de la amantadina IC 50 en la concentración de NMDA. La línea continua muestra la predicción del modelo 1 cuando cada constante de equilibrio canal bloqueado igualó la correspondiente constante de equilibrio de canal no bloqueado (K a K a 11 K m g g K 39 K K ds ds 0.2). Las otras tres líneas cada espectáculo predicciones después del ajuste de una constante y obtener la amantadina medido previamente (Blanpied et al., 1997) IC50 de 38,9 m de 5 m de NMDA equilibrio (ver leyenda de la Fig. 3 C). Ajustes constantes de equilibrio fueron los siguientes: K a 25,9 m (guiones largos), K ga 110 (trazos cortos), o ds K a 0,0304 (línea de puntos). Cada una de estas manipulaciones disminución de la proporción de los canales bloqueados en el estado abierto en el equilibrio. Los círculos cerrados muestran los valores medios de la amantadina IC 50 medidos en presencia de las concentraciones indicadas de NMDA además de 10 m glicina. Efecto de la amantadina en gating canal. A . Los estallidos de los orificios de un solo canal activadas por NMDA en 0 (arriba) y 30 m amantadina (parte inferior) de un solo parche. B. histogramas-duración de la ráfaga derivados del parche usado para A en 0 (parte superior) y 30 m amantadina (parte inferior). Las líneas continuas son ajustes de doble exponencial a cada histograma. Las flechas indican la media aritmética longitud de la ráfaga en el control (8,46 m) y 30 m amantadina (5,63 ms). C. La dependencia de la concentración de la amantadina media aritmética estalló duración. Los puntos se miden duración de la ráfaga cada punto representa las medias de los datos de parches 4-10. La línea continua es el mejor ajuste de la ecuación 2 para estallar duración valores, con k y k - fijo en sus valores medidos (. 40,8 m -1 s -1 y 4480 s -1, respectivamente) y se fija en 126 s -1 ( inverso de control de medida Media duración de la ráfaga). El mejor ajuste se logró con (el único parámetro libre) 251 s-1. o 1.99. La línea punteada muestra la duración media de ráfaga predicha a partir de la ecuación 2 con k. k -. y ajustado a los valores indicados arriba y fijados a 357 s -1 (2,83 leyenda, véase la Fig. 3 C). D. Predichos curvas de concentración-inhibición para tres inhibidores se comparan: amantadina (línea continua) se une al canal abierto (Kd 110 m), bloquea el flujo de corriente cuando se une y estabiliza el canal cerrado Estado (K g 2,83 K g) Bloque solamente ( línea discontinua) se une al canal abierto (Kd 110 m), bloquea el flujo de corriente cuando se une, pero no tiene efecto en el canal compuerta de apertura de puerta solamente (línea punteada) se une al canal abierto (Kd 110 m), no bloquea la corriente fluir cuando se unen, pero estabiliza el canal estatal cerrado (K g 2,83 g K). curvas predichas fueron derivados (ver material complementario. disponible en www. jneurosci. org) a partir del modelo 1 con A 5 m. K a K a. y K ds ds K K a. Kg . y ds K se fijaron en los valores dados en Materiales y Métodos. Las predicciones de montaje y de ecuaciones se realizaron en 7 Origen (Origin, Northampton, MA) o SigmaPlot 8 (SPSS, Chicago, IL). Los errores en barras de texto y de error en las cifras indican SEM. Resultados Las tasas de bloque de la amantadina y desbloquear Se investigaron la cinética del bloque de 3-100 m amantadina de canales individuales activadas por NMDA 5 m más 10 m glicina en parches exterior hacia fuera a un potencial de mantenimiento de -67 mV. La amantadina no afectó a la amplitud de un canal actual de canales activadas por NMDA abiertas pero inducidas breves, cierres de parpadeo que interrumpe aberturas de canal (Fig. 1 A). Como se aumentó la concentración de la amantadina, la frecuencia de breves cierres aumentó, causando una disminución en la duración de aberturas de canal (Fig. 1 A, B). La población de breves cierres observados en presencia de la amantadina (Fig. 1 A, C) son típicos de canal abierto fármacos bloqueadores con una cinética intermedios (Hille, 2001). Nos aprovechamos de la cinética del bloque de la amantadina para medir las constantes de velocidad aparente del bloque de amantadina (Neher y Steinbach, 1978) (k) y desbloquear (k -) directamente de las grabaciones de un solo canal. causas amantadina parpadeantes bloqueo de los canales de los receptores NMDA. A . El exterior hacia fuera registros de patch-clamp de aberturas de los canales activados a -67 mV por 5 m NMDA además de 10 m de glicina con 0, 10, y 100 m amantadina. Líneas por encima de la traza de la parte superior de cada par indican una región mostrada en una escala de tiempo más rápido en la traza de fondo. Todos los restos son de un solo parche. B. - Tiempo abierto histogramas desde el parche se muestra en A en las concentraciones correspondientes amantadina. Las líneas son ajustes de un solo exponencial a los histogramas. C. En tiempo cerrado histogramas del parche mostrado en A. Las líneas son ajustes exponenciales triple al histograma. Tenga en cuenta el cambio de escala en el eje y en el gráfico inferior. Para estimar k. que mide la duración media de las aberturas del canal (O) en ausencia (control, O, C) y presencia (bloqueador, O, B) de la amantadina (Fig. 1 B). Como era de esperar para un bloqueador de canal abierto (Neher y Steinbach, 1978), un gráfico de la recíproca de O como una función de la concentración de la amantadina (B) era bien ajuste por la ecuación 1 / O k B 1 / S, C. El valor de k. calculada como la pendiente de un ajuste de regresión lineal para todos los puntos de datos (Fig. 2 A), fue 40,8 m -1 s -1. Estimamos k - de la duración media de los cierres provocados por la amantadina (C, B), lo que refleja su tiempo de permanencia en el canal, y se aplica la ecuación (Neher y Steinbach, 1978) k - 1 / C, B. distribuciones de tiempo cerrado tanto en la ausencia y presencia de amantadina estaban bien ajuste por la suma de tres componentes exponenciales (Fig. 1 C). La amantadina parecía causar un aumento en la frecuencia de los cierres de duración más corta (Fig. 1 C). Llegamos a la conclusión de que este efecto de los resultados de amantadina de la similitud del valor de C, B y la duración media de los cierres más corta duración en ausencia de la amantadina en base a las siguientes observaciones: (1) amantadina tuvo poco efecto en la duración media o componente de tiempo de cerrado área relativa de los componentes más largos de la distribución en tiempo cerrado (Fig. 1 C) (2) la constante de tiempo de la más corta duración en la ausencia o presencia de la amantadina (C, S) varió poco en un amplio rango de concentraciones amantadina, incluso cuando se representó por tan poco como 60 o hasta el 95 de todos los cierres (Fig. 2 B) y (3) el área relativa del componente de duración más corta aumentaba con la concentración amantadina (Fig. 1 C . 2 C). Los posibles errores en la medición de C, B. fueron minimizados como se describe en Materiales y Métodos. El valor medio de C, B fue 0,223 0,012 ms (n 13), produciendo una estimación del k - para la amantadina de 4480 s-1. La divergencia de K d y IC 50 de la amantadina Con los datos anteriores, la constante de unión de la amantadina con el canal abierto de NMDA receptores (K d) de equilibrio de disociación pueden ser estimadas (Hille, 2001) a partir de la ecuación K d k - / k. produciendo Kd 110 m. Esta K d es considerablemente mayor que la amantadina IC 50 (38.9 4.6 m) que se midió bajo condiciones similares en experimentos de células enteras (Blanpied et al. 1997), un valor de acuerdo con la amantadina promedio IC 50 (35 m) medida electrofisiológica por otros (Parsons et al. 1999a 1995. 1996. Sobolevsky y Koshelev, 1998 Sobolevsky et al., 1998 Sobolevsky y Yelshansky, 2000 Bolshakov et al., 2003). La observación de que Kd IC 50 implica que la amantadina inhibe la corriente total mediada por el receptor de NMDA con más eficacia que bloquea los canales individuales abiertas. Una posible explicación para la diferencia entre el K d de la amantadina (medido en experimentos de parche) y IC 50 (medido en experimentos de células enteras) es que la escisión parche aumenta la IC 50 de la amantadina, como se observa para el bloque de canal de receptor de NMDA por Mg interna 2 (Li-Smerin et al. 2000. 2001). Si esta explicación fuera correcta, entonces el IC 50 de amantadina medido en parches exterior hacia fuera debe ser similar a la Kd. 110 m. Hemos probado esta posibilidad mediante la medición de la dependencia de la concentración de la amantadina el tiempo de apertura total del canal (n P abierto) durante las grabaciones de parche exterior hacia fuera. De montaje de la Ecuación 1 para normalizado n P abierta (Fig. 2 D) produjo una IC 50 de 29,7 m (n H 1,1), de acuerdo con razonable anterior de células enteras IC 50 mediciones. Este resultado entra en conflicto con la hipótesis de que la escisión parche aumenta la IC50 de la amantadina y sugiere que una explicación de la discrepancia entre Kd e IC 50 debe buscarse en el mecanismo de acción amantadina. La relación entre el K d y IC 50 de un bloqueador de los canales depende de cómo el bloqueador afecta a las transiciones de los canales después de la unión. Por ejemplo, los bloqueadores que actuar por el secuencial (o los pies en la puerta) mecanismo, que impiden el cierre del canal mientras que bloquea, inhibe las respuestas de células enteras (o parche P abierta n) mucho menos eficaz que bloquean una sola corrientes de los canales (K d IC 50) (Neher y Steinbach, 1978 Hille, 2001 Johnson y Qian, 2002). La amantadina, por el contrario, se sabe que es un bloqueador de los canales de captura: permite el cierre de canal mientras está unido en el canal de los receptores NMDA (Blanpied et al 1997 Sobolevsky y Yelshansky, 2000 Bolshakov et al., 2003).. Sin embargo, se ha encontrado incluso que atrapan bloqueadores de los canales de inhibir parcialmente cierre del canal durante el bloque (Johnson y Qian, 2002), lo que lleva a un IC 50 que es mayor que la K d. Sin embargo, para la amantadina, K d es mayor que 50 IC. una diferencia que no puede ser el resultado de la inhibición parcial de cierre del canal. La observación de que K d IC 50 para la amantadina es incompatible con la hipótesis de que inhibe las respuestas de NMDA simplemente bloqueando el flujo de corriente a través del canal. Esta desigualdad implica que los estados no conductores con amantadina con destino (que no existen para un bloqueador secuencial) son de gran importancia para su mecanismo de acción. Para entender mejor cómo la amantadina inhibe las respuestas de NMDA, se utilizó un modelo de bloques canal atrapando, que incluye los estados cerrados, amantadina de ruedas. Mediante la combinación de modelos de simulación con los datos de célula entera y de un solo canal, hemos probado si este modelo puede explicar la diferencia entre el CI y 50 Kd de la amantadina. El modelo atrapando bloque de canales que utilizamos (Fig. 3 A) se deriva de un trabajo previo en bloque de canales de los receptores NMDA (Benveniste y Mayer, 1995 Blanpied et al., 1997 Chen y Lipton, 1997 Dilmore y Johnson, 1998 Sobolevsky et al., 1998 Sobolevsky y Yelshansky, 2000) y los receptores nicotínicos de la acetilcolina (Lingle 1983 Ogden y Colquhoun, 1985). La parte superior de cinco estados de modelo 1 describen el comportamiento de los receptores NMDA en ausencia de bloqueadores, mientras que las más bajas cinco estados describen la capacidad de la amantadina para ser atrapado en los canales cerrados. El modelo no incluye etapas de unión de glicina debido a una concentración de glicina de saturación se incluyó en todas las soluciones. El modelo comprime múltiples cerrado, liganded, estados nondesensitized en un solo estado, A 2 R (ver Discusión). reproducción fiel del comportamiento del receptor de NMDA en todas las condiciones claramente requeriría un modelo mucho más complejo. Sin embargo, en la actualidad es insuficiente comprensión de los receptores NMDA para desarrollar un modelo completo y preciso. Modelo 1 se ha encontrado para reproducir con exactitud sorprendente una amplia gama de propiedades de los receptores de NMDA y bloqueantes de los canales y para ser altamente útil para la prueba de hipótesis (Dilmore y Johnson, 1998 Anson et al. 2000). Aplicamos el modelo 1 para determinar si, y si es así cómo, la relativamente baja IC 50 con la que la amantadina inhibe las respuestas de células enteras de NMDA se puede explicar por su acción conocida como un bloqueador de captura. Debido a que el modelo fue utilizado para simular las mediciones de células enteras de estado estable, se necesitaba consideración únicamente de las constantes de equilibrio (no evaluar las constantes). Para reducir al mínimo el número de parámetros ajustables, las constantes que definen los equilibrios entre los estados no bloqueados (K a. K ds. Y K g) se fijaron como se describe en Materiales y Métodos, y Kd se fijó en 110 m basado en el simple por encima de mediciones de canal. Se determinó si la amantadina podía bajar su IC 50 con relación a su K d por que afecta a una cualquiera de las tres constantes restantes, todos los cuales define los equilibrios entre los estados bloqueados: unión agonista (K a una K), la desensibilización (K ds K ds), A . B.